限制性內(nèi)切酶的一般原則和建議

　　限制性內(nèi)切酶的一般原則和建議

　　DNA中加上酶，然后保溫一段時(shí)間就可以了。但是在實(shí)際操作過(guò)程中，我們不斷聽(tīng)到：切不動(dòng)，裝不上。問(wèn)題在什么地方？能系列生產(chǎn)限制性內(nèi)切酶的公司國(guó)際上，就那么幾個(gè)，位列前3的是NEB,Fermentas,SibEnzyme。這些公司提供酶的品質(zhì)一般都能得到保證。您可以懷疑酶的質(zhì)量問(wèn)題，但是更多的問(wèn)題來(lái)源于模板是否合適酶切要求。下面幾點(diǎn)對(duì)你的酶切是有幫助的。

　　1)成功酶切的關(guān)鍵是準(zhǔn)備好模板DNA。DNA樣品中不能含有有機(jī)溶劑（會(huì)使酶變性或產(chǎn)生星號(hào)貨性），不能含有干擾酶活性的污染物質(zhì)，不能含有高濃度的EDTA(TE中的EDTA濃度較低，對(duì)Mg的濃度影響較小)；同時(shí)要對(duì)DNA甲基化程度及其對(duì)酶切效率的影響要做到心中有數(shù)。

　　2)選用合適的酶。根據(jù)酶切序列選用，特別注意選用甲基化對(duì)酶活性的干擾。

　　3)正確使用和保存酶。酶需要保存在-20度的低溫環(huán)境中，只是在需要用酶才從冰箱中取出來(lái)。運(yùn)輸和臨時(shí)存放時(shí)需要將酶至于冰上。手拿酶管時(shí)不要接觸酶管下步含酶的部分，移酶時(shí)盡可能用長(zhǎng)TIP,避免污染。用完后需要及時(shí)送回原處。注意：酶通常是最后加。

　　4)反應(yīng)體積需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩?，常?guī)的酶切一般要維持在10-50ul，酶切鑒定10-20ul就可以了。

　　5)模板濃度問(wèn)題：濃度過(guò)高，溶液黏度過(guò)大，酶不能有效擴(kuò)散，酶切效果不會(huì)好。濃度過(guò)低，也會(huì)影響酶活性。

　　6)注意模板用量和反應(yīng)體積的關(guān)系。對(duì)酶用量，模板用量，反應(yīng)體積等要素的確定需要的是時(shí)間和經(jīng)驗(yàn)的積累。

　　7)酶切反應(yīng)的各個(gè)組分加完后，需要用TIP小心混勻幾次，shortspin一下就可以保溫了。一般不能使用振蕩器混勻。

　　8)反應(yīng)溫度的選擇。一般反應(yīng)都用37度，但是SmaI的適合溫度是25度，37度時(shí)酶仍表現(xiàn)出活性，但是效率下降50%。部分從耐熱菌制備的酶需要在37度以上的溫度反應(yīng)，如TaqI的最適溫度為65度，37度保溫，效率僅為前者的1/10。

　　9)反應(yīng)時(shí)間的選擇。一般酶切鑒定30分鐘就可以了。要*酶切可以采用少量的酶長(zhǎng)時(shí)間反應(yīng)，或較高的酶量短時(shí)間處理都可以達(dá)到。在使用高酶量的時(shí)候需要注意甘油的最終濃度不要超過(guò)5%，也就是說(shuō)10ul的體系，酶的用量不要超過(guò)1ul。

　　10)是否和如何終止反應(yīng)？酶切鑒定之類的實(shí)驗(yàn)不需要特殊處理。滅活的手段：加入高濃度的EDTA；65度或80度熱處理20-30分鐘；部分從高溫菌純化出來(lái)的內(nèi)切酶由于最適的反應(yīng)溫度比較高，熱處理滅活不一定*，需要用苯酚/氯仿/乙醇方法純化；電泳回收也是實(shí)驗(yàn)室常用除酶的手段。