發(fā)布時(shí)間: 2022-01-19 點(diǎn)擊次數(shù): 1363次
PCR儀重要的就是升降溫過(guò)程,起初的水浴鍋式PCR,就是三個(gè)水浴箱,一個(gè)機(jī)械臂,定時(shí)抓出反應(yīng)槽轉(zhuǎn)換水浴鍋。這種儀器體積大,迅速慢,但其實(shí)結(jié)果并不比以后的PCR儀差。后來(lái)有人利用致冷和加熱做成了固定位置升降溫的PCR擴(kuò)增儀。后來(lái)隨著定量技術(shù)的發(fā)展,有將擴(kuò)增儀和檢測(cè)做成一體,也就成了現(xiàn)在的實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。
PCR儀的兩大誤區(qū)分析:
1.儀器通道越多越好
隨著PCR技術(shù)的成熟運(yùn)用,熒光定量PCR儀也是如此。從單通道熒光定量PCR儀發(fā)展到如今各個(gè)廠家都推出4通道、5通道甚至6通道熒光定量PCR儀,眼花繚亂的選擇讓人無(wú)所適從,稍不小心就可能走進(jìn)“通道越多越好”的誤區(qū)。
在使用有些5通道的熒光定量PCR儀時(shí),為了確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的精確性和準(zhǔn)確性都要在實(shí)驗(yàn)中使用ROX(一種熒光染料),這些熒光染料都必須單獨(dú)使用一個(gè)檢測(cè)通道。這樣以來(lái),真正能檢測(cè)多重PCR熒光信號(hào)的有效通道只有4個(gè),而且使用校正染料可能會(huì)增加后期的使用成本。有的熒光定量PCR的檢測(cè)通道是只為自已廠家的專用的熒光染料或試劑開(kāi)放的,有效檢測(cè)通道也絕非像宣傳的那么多。因此在購(gòu)買前確認(rèn)熒光定量PCR儀器的有效檢測(cè)通道尤為重要。
2.real-time PCR儀無(wú)需梯度功能
對(duì)于使用染料法的定量PCR反應(yīng),雖然有各種各樣的PCR引物設(shè)計(jì)軟件或者經(jīng)驗(yàn)公式計(jì)算熔解溫度(Tm值),但運(yùn)用的公式不同、引物序列不同,Tm值的差異會(huì)很大。引物的熔解溫度決定了退火溫度。而且模版中堿基的組合千變?nèi)f化,對(duì)于特殊片斷,經(jīng)驗(yàn)公式得到的數(shù)據(jù)不一定能得出準(zhǔn)確的結(jié)果,退火溫度細(xì)微的差異對(duì)結(jié)果都可能產(chǎn)生決定性的影響,因而“摸條件”一度是讓人很頭疼的問(wèn)題。梯度PCR的出現(xiàn)部分解決了一些問(wèn)題-在反應(yīng)過(guò)程中每個(gè)孔的溫度控制條件可以在規(guī)定范圍內(nèi)按照梯度變化,根據(jù)結(jié)果,一步就可以摸索出適合的反應(yīng)條件。
不單退火溫度,連變性溫度和延伸溫度都可以優(yōu)化-對(duì)于多種聚合酶混合酶擴(kuò)增來(lái)說(shuō)這個(gè)非常重要,因?yàn)門aq和校正酶的佳反應(yīng)溫度可能有顯著差異,優(yōu)化延伸溫度就顯得很重要。
使用有梯度功能的熒光定量PCR儀可以一次完成以往多次實(shí)驗(yàn)才能完成的優(yōu)化過(guò)程,簡(jiǎn)化了摸索PCR反應(yīng)條件的繁瑣實(shí)驗(yàn),既節(jié)省實(shí)驗(yàn)時(shí)間提高效率,又節(jié)省實(shí)驗(yàn)成本。